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一、原理
1。熒光染料 Hoechst 33342 能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上低藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342 比正常細(xì)胞的多，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高，此外，凋亡細(xì)胞的染色體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA 結(jié)合，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342 排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。

2．PI 染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中，即活細(xì)胞對(duì)PI 染料拒染，而壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI 染料染色。

3．根據(jù)這些特性，用Hoechst 33342 結(jié)合PI 染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色，就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來(lái)。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色（Hoechst 33342+/PI+），凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色（Hoechst 33342+/PI++）。
二、試劑材料
Heochst 33342 染液1.0mL
Propidium Iodide （PI）500 ul
10×PBS 10 mL
三、操作步驟
1. 懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞離心收集，固定培養(yǎng)的細(xì)胞消化收集后，將105~106 個(gè)細(xì)胞懸浮于1ml 培養(yǎng)基中，再加入10ul Heochst 33342 染液，混勻，370C 孵育5-15 min；
2. 細(xì)胞于 40C 500 ~ 1000r/min 離心5min 棄去上清液；
3. 加入1.0ml PBS 懸浮細(xì)胞，加入5 ul PI 染液，避光混勻；
4。流式細(xì)胞儀分析或熒光顯微鏡觀察：Heochst 33342 用氪激光激發(fā)的紫外光，激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，發(fā)射波長(zhǎng)為400 ~ 500nm，產(chǎn)生藍(lán)色熒光；PI 用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長(zhǎng)為488nm，發(fā)射光波波長(zhǎng)大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖。結(jié)果判斷：在藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的散點(diǎn)圖上，結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光，壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光。
四、注意事項(xiàng)
1. 在紅色熒光對(duì)藍(lán)色熒光散點(diǎn)圖上，還可見(jiàn)到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故。
2. 用Heochst 33342 染料與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在20min 之內(nèi)為宜。如果太長(zhǎng)可引起Heochst33342 的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移，導(dǎo)致紅色熒光與藍(lán)色熒光的比例改變，從而影響結(jié)果的判斷。
3.Propidium Iodide （PI）有毒，操作時(shí)要戴手套。